Фильм вновь погружает нас в жизнь удивительного, доброго и отзывчивого Питера Паркера, по совместительству Человека-паука, отважного борца с непримиримыми врагами человечества и кумира миллиона мальчишек. И если в жизни Человека-паука все ровно, то в жизни Питера Паркера все пошло наперекосяк. Питер теряет работу в одной из пиццерий города и находится на грани увольнения в журнале Дейли Бьюгл. Ко всему прочему его возлюбленная Мери Джейн планирует замужество с Джоном, который является сыном его начальника в журнале. Любимой тетушке грозит потеря жилья, а друг Гарри не отступился от мечты расквитаться с Человеком-пауком за смерть отца. В это время успешный ученый Отто Октавиус проводит эксперимент, который спонсирует Гарри Озборн. В результате чего Отто превращается в злобного Доктора Осьминога, одержимого мечтой повторить свой эксперимент. Но для этого ему нужен тритий. Поразмышляв где добыть редкое вещество, Доктор Осьминого решает заключить сделку с Озборном. Гарри предоставляет злодею тритий, а Доктор преподносит ему Человека-паука. Гарри соглашается. В это время Человек-паук вдруг осознает, что его силы уже не те и отказывается от карьеры супергероя. Его костюм оказывается в редакции журнала Дейли Бьюгл, а сам бывший кумир Нью-Йорка пытается жить обычной жизнью Питера Паркера. Но так продолжается недолго, Осьминог, пытаясь найти Человека-паука, похищает Мэри Джейн и просит Питера передать герою прийти на встречу, иначе девушке сильно не поздоровиться. Паркеру ничего не остается, кроме как вновь одеть костюм и отправится в лапы к Доктору Осьминогу. После страшной схватки Человек-паук оказывается у Гарри Озборна, а обезумевший Доктор получает свой тритий.